清华大学基础完美体育·(中国)官方网站丁强课题组建立基于水疱性口炎病毒载体的复制型重组SADS-CoV冠状病毒细胞模型

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近些年来，冠状病毒感染在人类和动物中频繁出现，因此有必要预防病毒从动物到人类的传播风险1。2016年，我国广东省爆发了猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV），导致5日龄以下仔猪死亡率高达90%。SADS-CoV是一种单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科a冠状病毒属，其基因组大小约为27.2 kb，与菊头蝠冠状病毒HKU2的核苷酸序列同一性为95%2-4。SADS-CoV在体外条件下，能够感染包括蝙蝠、小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、猪、鸡、非人类灵长类动物以及人类的细胞系5，呈现出广泛的物种嗜性，具有跨物种传播的潜在风险。然而，由于缺乏研究病毒入侵的工具以及缺乏疫苗或抗病毒疗法，使这种威胁持续存在。

水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）载体经过基因工程改造，已成为一个安全、高效的疫苗载体。VSV病毒载体可以高效地利用非同源的病毒蛋白进行假型化（pesudotyped），用于那些难以体外培养、致病性强的病原体，在研究病毒颗粒入侵、筛选抗病毒药物以及疫苗开发方面有着广泛的应用6-8。

近日，清华大学基础完美体育·(中国)官方网站丁强课题组在《Journal of Virology》发表题为《Establishment of replication-competent vesicular stomatitis virus recapitulating SADS-CoV entry》的研究论文。该研究建立了携带新型猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）刺突蛋白基因的复制型重组VSV病毒（VSV-SADS spike），该模型可模拟SADS-CoV入侵宿主细胞，且可在小鼠体内诱导针对SADS-CoV spike的中和抗体，显示其作为病毒载体疫苗的潜力。丁强课题组博士研究生朱子慧设计了VSV的感染性分子克隆，用SADS-CoV spike基因替换其糖蛋白（G）基因，并在3'前导区插入Venus报告基因（图1A），以生成具有复制能力的重组rVSV-Venus-SADS S病毒。将基因组质粒和表达N、P、G、M、L和T7 RNA聚合酶的辅助质粒转染进HEK293T细胞中。收获转染4天后的上清用于感染Huh7.5.1细胞，然而初始的感染信号比较弱，这意味着P0中的病毒产量相对较低。研究人员将rVSV-Venus-SADS S病毒在Huh7.5.1细胞中进行了连续传代，以获得适应性突变病毒（图1B）。

图1 设计和拯救复制型rVSV-Venus-SADS S病毒

通过对P6代病毒基因组测序发现，在S蛋白C端胞质区发生了一个点突变，该突变将原始Q1120突变为终止密码子，导致翻译终止。这导致S蛋白C端末尾11个氨基酸缺失，缩写为S∆11。为了评估这种突变是否赋予了适应性表型，研究人员拯救了rVSV-Venus-SADS S∆11病毒，发现其具有更强的感染能力（图2A）。通过分析S和S∆11的表达分布，发现S∆11蛋白具有更高地定位到细胞膜的能力，使其更有效地融入VSV病毒颗粒。进一步地，研究人员证明rVSV-Venus-SADS S∆11的感染可以被SADS-CoV S1多克隆抗体特异性抑制，而rVSV-Venus-SARS-CoV-2 S不受影响（图2B）。这一观察结果表明rVSV-Venus-SADS S∆11感染是由SADS-CoV刺突蛋白介导。从而验证了该重组病毒在研究SADS-CoV入侵和评估抗病毒策略方面的实用性。

图2 重组VSV-SADS病毒的生长曲线和中和曲线

基于重组VSV的疫苗平台已成功用于多种病毒，例如已经上市的rVSV-ZEBOV疫苗。因此，研究人员旨在确定rVSV-Venus-SADS S∆11作为小鼠模型中潜在疫苗候选物的免疫原性。为了评估对rVSV-Venus-SADS S∆11的免疫反应，研究人员用8×106 FFU的rVSV-Venus-SADS S∆11免疫6周龄C57BL/6雌性小鼠，而对照组接受PBS。在初次接种14天后，通过肌肉注射的途径接种相同剂量的加强针（图3A）。与接种前相比，初免和加强免疫可诱导针对rVSV-Venus-SADS S∆11感染的有效中和抗体。此外，其中五只小鼠接种加强针后体内产生了针对SADS-CoV真病毒感染的中和抗体（图3B）。

图3 VSV-SADS免疫小鼠诱导产生针对SADS-CoV的中和抗体

综上所述，该研究成功开发了一种基于安全实用的工具，用于研究SADS-CoV细胞进入和探索重组VSV载体SADS-CoV疫苗的潜力。这些工具为未来开发针对 SADS-CoV和类似新兴病毒的预防性干预措施铺平了道路。

清华大学基础完美体育·(中国)官方网站丁强副教授是该研究论文的通讯作者。课题组博士生朱子慧为该论文的第一作者，博士生龚明丽和孙波参与了此工作。复旦大学张荣教授和韩雨桐同学也为研究提供重要支持。

该研究得到了国家自然科学基金（82341084、82272302、82241077和32070153）、国家重点研发计划（2021YFC2300200-04和2023YFC2305900）、北京市自然科学基金（Z220018）、清华大学万科公共卫生与健康学科发展专项基金（2022Z82WKJ013）以及山西医科大学-完美体育·(中国)官方网站前沿医学协同创新中心的支持。

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论文链接：

https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.01957-23?url_ver=Z39.88-2003