2024年8月15日，清华大学基础完美体育·(中国)官方网站丁强课题组在《美国国家科学院院刊》（PNAS）发表题为“寨卡病毒NS5蛋白利用宿主CRL3泛素连接酶降解STAT2从而抑制干扰素反应”（ Zika Virus NS5 Protein Inhibits Type I Interferon Signaling via CRL3 E3 ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of STAT2）的研究论文。该研究揭示寨卡病毒NS5蛋白通过招募CRL3泛素连接酶及其底物识别蛋白ZSWIM8，降解干扰素信号通路中的关键蛋白STAT2，从而抑制宿主抗病毒天然免疫的分子机制，并阐明该逃逸机制在病毒感染中的重要作用。

寨卡病毒（ZIKV）是单股正链RNA病毒，与登革病毒（DENV）、西尼罗病毒（WNV）和黄热病毒（YFV）等均属于黄病毒科黄病毒属¹。寨卡病毒对人类健康构成严重威胁，尤其对孕妇和胎儿更具危险性。感染孕妇后，病毒可穿过血胎屏障，感染胎儿神经前体细胞（Neural Progenitor Cells），引发细胞凋亡，导致新生儿小头畸形^2,3。寨卡病毒利用多种机制逃避宿主的免疫系统，从而成功感染宿主并繁殖。泛素化是一种在细胞中普遍存在的蛋白翻译后修饰方式，广泛参与机体对病毒感染后的免疫应答和信号传导过程^4,5。寨卡病毒NS5蛋白具有RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp) 和 RNA 甲基转移酶 (MTase)两个结构域，负责病毒基因组RNA的复制和甲基化修饰^6,7。除了对病毒生命周期至关重要的酶活性外，NS5也在拮抗宿主免疫反应中发挥关键作用。例如，西奈山伊坎完美体育·(中国)官方网站（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）的Adolfo Garcia-Sastre教授课题组在2016年报道，寨卡病毒NS5蛋白通过蛋白酶体途径促进STAT2的降解，但具体的E3泛素连接酶尚不明确⁸。因此，鉴定直接参与降解STAT2的E3泛素连接酶并揭示其分子机制，对于理解寨卡病毒逃逸宿主免疫系统的策略，以及开发相关疾病的预防和治疗方法具有重要意义。

为了解决这一科学问题，研究团队利用HEK293T细胞，构建了ZIKV NS5介导STAT2降解的可视化报告细胞系。该细胞系可组成型表达STAT2-mCherry红色荧光融合蛋白，而ZIKV NS5的表达则受四环素诱导型表达系统Tet-On的调控。通过添加四环素类药物诱导NS5的表达后，可以利用流式细胞术或荧光显微镜观察到STAT2-mCherry的有效降解。利用该报告细胞系，结合CRISPR/Cas9全基因组筛选系统，作者筛选出一系列影响NS5介导STAT2降解的宿主基因（图1）。其中，ZSWIM8基因引起作者的重点关注，该基因是Cullin-RING泛素连接酶（CRL）复合体的底物识别蛋白，该复合体参与降解microRNA代谢途径的多个关键蛋白^9,10。

图1. CRISPR/Cas9全基因组敲除文库筛选流程图

实验结果表明，敲除ZSWIM8可有效抑制ZIKS NS5介导的STAT2降解，而过表达ZSWIM8则可促进其对STAT2的降解。通过对Cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)家族基因逐一敲除，研究团队鉴定出CRL3是负责STAT2降解的功能性E3泛素连接酶。NEDD8类泛素化修饰对于CRL3的泛素连接酶活性至关重要，实验结果也表明NEDD8激活酶抑制剂MLN4924可以抑制NS5介导的STAT2的降解。随后，通过一系列生化实验，研究人员发现病毒 NS5 蛋白作为一个衔接蛋白，使得 CRL3 - ZSWIM8 与STAT2发生相互作用，并对STAT2进行泛素化修饰，进而促进其蛋白酶体降解。在A549细胞系和神经前体细胞中，研究团队探讨了病毒挟持CRL3-ZSWIM8复合物降解STAT2对病毒感染的影响。实验结果表明，在以上两种细胞中，敲除ZSWIM8后，ZIKV感染无法诱导STAT2降解，干扰素诱导基因（ISG）显著上调，病毒感染明显受到抑制；而同时敲除ZSWIM8和STAT2则可完全恢复病毒的感染能力，说明敲除ZSWIM8后病毒感染受到的抑制是因为不能有效降解STAT2所导致。以上结果表明，ZIKV感染细胞后可引发宿主产生干扰素，然而病毒NS5蛋白可挟持CRL3-ZSWIM8 E3泛素连接酶实现对STAT2的降解，从而逃逸干扰素信号转导通路，实现高效感染（图2）。

图2. ZIKV NS5利用CRL3-ZSWIM8 E3连接酶复合物抑制干扰素信号通路

综上所述，本研究发现寨卡病毒利用CRL3-ZSWIM8复合体降解宿主干扰素信号转导系统关键蛋白STAT2，揭示寨卡病毒拮抗宿主抗病毒天然免疫的分子机制。利用化学抑制剂和遗传敲除技术证明该逃逸机制在病毒建立感染以及致病过程中发挥重要作用。该研究不仅促进了对寨卡病毒生命周期和致病机制的认识，也为相关疾病的预防和治疗提供了新靶点和新思路。

清华大学基础完美体育·(中国)官方网站丁强副教授为本文通讯作者，清华大学基础完美体育·(中国)官方网站任文琳博士为第一作者，课题组张羽、鞠晓辉、宋晶伟、龚明丽、李卓阳也参与该课题的研究。清华大学生命学院姚骏教授以及课题组付崇雷和姜熙为本研究做出重要贡献。浙江大学番文春教授和武汉大学雷曹琦教授也为该研究提供宝贵意见。该研究在国家重点研发计划（2021YFC2300200-04和2023YFC2305900）、国家自然科学基金（82341084, 82272302, 82241077和32070153）、北京市自然科学基金（Z220018）、清华大学笃实基金(20231080039)、清华大学万科公共卫生与健康学科发展专项基金（2022Z82WKJ013）和山西医科大学-完美体育·(中国)官方网站前沿医学协同创新中心等资助下完成。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2403235121

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