2023年4月14日，清华大学药学院/北京生物结构前沿研究中心刘翔宇课题组与斯坦福大学Brian Kobilka课题组，德国弗里德里希-亚历山大-埃尔朗根-纽伦堡大学化学与药理学系Peter Gmeiner教授课题组及加州大学圣地亚戈分校药理学系Roger Sunahara教授课题组合作在《自然通讯》（Nature Communications）杂志联合发表题为“构象限制的儿茶酚胺通过变构效应获得对β2肾上腺素受体的选择性”(Constrained catecholamines gain β2AR selectivity through allosteric effects on pocket dynamics)的文章。该工作报道了一个出乎意料的发现，即在引入两个碳原子限制肾上腺素的构象之后，构象限制的肾上腺素（或去甲肾上腺素）获得了对β2肾上腺素受体（β2AR）上百倍的选择性（相较于序列非常相似的β1AR）。研究人员结合晶体学、配体结合动力学、G蛋白偶联受体信号转导实验、分子动力学模拟等多种手段，发现即使是具有相同正构配体结合口袋的G蛋白偶联受体亚型，如β1AR和β2AR，正构配体结合口袋的形状和稳定性也会受到周围残基的影响，从而导致配体亲和力的显著差异。该工作为设计和优化G蛋白偶联受体的亚型选择性配体提供了新思路。

想象一下有两间看着大小、材质都一模一样的小房子，房子高度都和你差不多，你走进去呆着感觉不到什么差别。而当你带上一顶厚帽子再走进去的时候，就感觉其中一间小房子很舒服，另一间特别别扭。你仔细找为什么会这样？然后发现其中一间的房顶是活动的。厚帽子虽然蹭着房顶，但是你不觉得挤。而另一间的房顶比较固定，你走进去就觉得硌着了。

本工作发现的差不多就是这样一件事情。肾上腺素待在beta1或者beta2的结合口袋（小房子）里面的时候，感觉都差不多。但是带了厚帽子的肾上腺素（c-Epi）就只喜欢beta2的口袋。研究者们找了半天发现在beta2里面，小房子的屋顶（F45.52）活动性较强，结合c-Epi时可以自己往上动一点点（0.8埃左右）。但是beta1里面就不行。研究者们进一步找到F45.52的活动性是受周围环境影响的，换了周围的环境（围绕它的四个氨基酸）以后，beta1又行了，而beta2就不行了。

所以，虽然一些GPCR的配体结合口袋（小房子）长的差不多，我们还是有办法找出喜欢其中某一个，而不喜欢另一个的化合物（亚型选择性药物）的。

G蛋白偶联受体(GPCRs)是重要的治疗靶点。基于GPCRs开发药物的主要挑战之一是避免脱靶副作用，并实现候选药物更大的亚型选择性。βARs参与调节如心跳、呼吸等关键的生理过程，是研究G蛋白偶联受体的经典模型。βARs受内源儿茶酚胺去甲肾上腺素(Norepi)和肾上腺素(Epi)的调控。Epi对于β₁AR和β₂AR具有相似的亲和力，而 Norepi则对β₁AR具有约为十倍的选择性。之前的研究表明，β₁AR和β₂AR的配体进入通道可能不同。分子动力学模拟的结果表明，配体的灵活性可能是影响配体通过胞外通道的重要因素。然而，当配体到达正构配体口袋时，配体的灵活性也会产生熵的限制，在结合口袋里它被限制为单一或有限的构象。为了研究配体灵活性的影响以及熵变对于儿茶酚胺与β₁AR和β₂AR结合的影响，我们合成了构象限制的肾上腺素（cEpi）, 去甲肾上腺素（cNorEpi）和异丙肾上腺素（cISO）来限制或约束可旋转键，并研究了它们的药理学和信号传导的性质（图一）。结果显示，构象限制的儿茶酚胺cEpi、cNorEpi和cISO均获得了对β₂AR的亚型选择性，其中cEpi对β₂AR的亲和力比β₁AR高了数百倍。

图一 构象限制的儿茶酚胺通过变构效应获得对β2肾上腺素受体的选择性

(a.构象限制的儿茶酚胺的设计与合成。b.c-Epi对β2AR的亚型选择性。c.c-Epi与β2AR的结合口袋及周围关键的差异氨基酸。 d. 突变受体正构位点周围残基影响c-Epi对受体的亲和力。)

为了探究构象限制的儿茶酚对β₂AR选择性的结构基础，我们解析了c-Epi和c-ISO与β₂AR复合物的高分辨率晶体结构。当比较β₂AR-Epi结构与β₂AR-c-Epi结构时，所有的正构配体口袋的残基位置都是相似的，除了F193^45.52侧链略有向上位移(~0.8 Å)。c-Epi和c-NorEpi与β₁AR和β₂AR结合的动力学研究表明，c-Epi与β₂AR的结合速度比Epi快，说明配体的构象限制促进了其与受体的结合。这可能是由于熵的优势，也可能是受构象限制增加的疏水作用的影响。为了试图确定影响构象限制的儿茶胺亲和力的关键氨基酸，我们进行了突变体研究。我们关注了F^45.52周围关键氨基酸的作用，在距离F^45.52 附近5 Å的氨基酸中，β₁AR和β₂AR有4个不同的残基，这些氨基酸会影响F^45.52所处环境，但不直接参与激动剂的结合。突变这四个氨基酸使得β₂AR对 c-NorEpi和c-ISO的结合效力降低，而β₁AR对c-NorEpi和c-ISO的效力增加。分子动力学模拟表明c-Epi在β₁AR的正构口袋并不稳定，而突变四个氨基酸的β₁AR与c-Epi结合模式更为稳定。由于c-Epi中两个碳的增加，需要由F193^45.52向上位移所创造的额外空间。而β₁AR中F^45.52周围残基的变构效应可能不允许其像β₂AR中那样向上移动。以上结果表明，正构位点周围残基的变构效应改变了口袋的形状，并有助于构象限制的儿茶酚胺获得对β₂AR的选择性。

德国弗里德里希-亚历山大-埃尔朗根-纽伦堡大学化学与药理学系的Peter Gmeiner教授，清华大学药学院刘翔宇教授，加州大学圣地亚戈分校药理学系Roger Sunahara教授，斯坦福大学Brian Kobilka教授为本文的通讯作者。清华大学药学院博士后许心宇博士为本文的第一作者。本课题得到了北京生物结构前沿研究中心、清华-北大生命科学联合中心、国家自然科学基金委、中国博士后科学基金等支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-37808-y