刘刚教授课题组近期在Chemical Communications（https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/cc/d1cc05187c）及European Journal of Medicinal Chemistry（https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2022.114835）发表了新型结核分枝杆菌单细胞荧光诊断试剂研究结果。该项研究由李雪媛博士、耿鹏飞博士生及洪小巧博士生等完成，并得到了首都医科大学北京胸科医院孙照刚博士的支持。

    结核病（Tuberculosis, TB）是由单一病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）感染引起的致死性传染病，严重地危害了公众的健康安全。1995年，世界卫生组织（WHO）将每年3月24日定为世界防治结核病日，以提醒公众加深对结核病的认识，并设定2035年为结核终结年，全球实现结核病<10 /100,000流行的目标。

    为了更好地降低TB 的发病率和死亡率，在病程早期就能够进行精准诊断尤为重要。目前，X-pert技术在结核病的诊断中得到了广泛应用，但细菌学检测仍然是最准确的方法。例如，在2020年全球被诊断出患有肺结核的患者中，59%是通过细菌学方法确诊的¹。细菌学主要包括细菌培养法和痰涂片镜检法。其中，培养法结合菌种鉴定被视为TB诊断的金标准，但检测时间较长；痰涂片镜检法，检测成本低，检测速度快，更适合 TB 的快速检测。临床上常用抗酸染色法和金胺O荧光染色法进行镜检观察（主要是痰样本），但这两种方法存在由染料残渣、杂质蛋白、纤维、食物残渣等引起的假阳性结果，且无法区分活菌和死菌状态等问题。区分死活菌对于早期准确评估治疗效果则至关重要，有助于指导调整用药方案。

  目前已报道了多种结核分枝杆菌新型荧光探针，由于临床痰液样本中存在不同的菌种和复杂的成分，对荧光探针的化学结构稳定性、光学稳定性、特异性以及样本处理稳定性等多方面均有较高的要求，因此，研究多停留在实验室水平，暂无成功转化的成果   

    刘刚教授课题组及合作伙伴首次发现天然四环双吡喃香豆素(+)-calanolide A的硝基呋喃衍生物（NFCs）对复制型和非复制型Mtb均具有很好的抑制作用²。 深入的机制研究表明，NFC类化合物进入菌内后，可被分枝杆菌中rv2466c基因编码的硝基还原酶Rv2466c识别，并在放线菌（Mtb属于放线菌目）所分泌的特有小分子硫醇mycothiol辅助下，NFC分子中的硝基基团被还原成氨基，此过程中释放的活性物质可对Mtb起到抑制作用，并伴有香豆素荧光团的荧光由淬灭到开启（off-on）的过程（图1）³， 这一现象被成功地应用于临床样本中Mtb的活力测定及药敏试验（drug susceptibility tests, DST）的高通量筛选，显著提高了药敏检测Mtb的速度和通量⁴。

图1. 天然四环双吡喃香豆素(+)-calanolide A衍生物的抗结核分枝杆菌活性及其检测应用

    

    在此基础上，刘刚教授课题组继续深入探索了NFC类化合物的荧光活性与结构之间的关系^5,6，发现部分NFC分子可标记单细胞Mtb，并通过在NFC分子中引入分枝杆菌细胞壁所特有成分，海藻糖trehalose（Tre），开发了 2 个蓝绿波段的 NFC-Tre 类荧光探针。该类分子具有较高的标记效率，对活的Mtb具有更好的选择性，并可实现对感染宿主巨噬细胞内Mtb的标记，为研究 Mtb 与宿主细胞之间的相互作用提供了新的工具分子；同时该类分子也首次实现对多种压力模型下的非复制状态Mtb标记染色，有望应用于研究潜伏性TB；此外，在临床阳性痰液样本中，该类分子能够检测出Mtb，可作为镜检分子对TB病人痰液中的Mtb进行检测（图2）。与萋-尼抗酸染色法和金胺O法相比，在操作步骤上NFC-Tre分子无需脱色处理，操作更加简便，缩短了检测时间。最后，该类分子是一个Rv2466c酶激活型探针，仅能标记活Mtb，可真实地反映痰液中活菌的状态及数量，具有应用于评估TB病人真实病情的潜力，或者用于评估服药患者短期内治疗效果的潜力，进一步指导临床用药方案⁶。

图2. NFC-Tre 类探针选择性标记宿主巨噬细胞内分枝杆菌和非复制Mtb

    回顾(+)-Calanolide A分子研究的整个过程，存在几个分子变身的关键事件（图3）。(+)-Calanolide A于1992年首次被发现为HIV-1的非核苷类逆转录酶抑制剂，因其具有独特的生物学及药学的分子特征，是目前唯一一个经过临床试验研究的天然抗艾滋病候选药物，刘刚教授课题组研究该分子已有20余年。然而，作为抗艾滋病药物的候选物，无论是天然化合物(+)-calanolide A本身，还是经过优化得到的更具成药性的分子F18^8-11，终因合成工艺制备问题、亦或是同类分子的竞争问题而止步于进一步的临床试验及开发。

图3. (+)-Calanolide A分子功能变身的关键事件

    (+)-Calanolide A于2004年再被发现具有抗Mtb的活性。在比尔-盖茨基金资助下，刘刚教授研究团队及其合作者（美国康奈尔大学完美体育·(中国)官方网站Carl F. Nathan教授）利用前者研究团队构建的相关化学库，瞄准发现同时抗复制型Mtb及非复制型Mtb的药物研究方向和目标，发现了具有高活性、可抑制感染宿主巨噬细胞内Mtb的NFC类分子，但止步于分子的基因毒性²。该类分子具有不同于其他抗结核药物的高活性及抑菌选择性，刘刚课题组及其合作伙伴对该类分子的作用机制进行了长达7年的研究，最终发现此类分子可在放线菌分泌的低分子量硫醇化合物mycothiol（MSH）的辅助下，被新型硝基还原酶Rv2466c还原，释放的活性氧产生了杀菌作用，并基本证明了三元复合分子RvMN（Rv2466c-MSH-NFC）间的相互作用方式。刘刚教授研究团队随后意识到，NFC类分子具有荧光探针香豆素的基本分子骨架特征，具有荧光被细菌“off-on”的可能性，并开发出了前文描述、可用于结核病药敏实验的新型荧光诊断试剂、以及Mtb单细胞荧光诊断试剂。

    值得强调的是，刘刚教授课题组观察到了有些能够在体外被Rv2466c还原的NFC抑菌分子，可以在菌外培养液中测到还原荧光分子，进而开发出新的药敏实验方法；但有些NFC分子的还原产物（荧光分子）却可能被“锚定”滞留在菌内，并进而开发了Mtb新型单细胞荧光诊断试剂。这一单细胞诊断技术具有很广泛的潜在应用前景，不仅可以提高临床菌学镜检技术的灵敏性，也能简化临床菌学镜检诊断的操作步骤，减少检验员的暴露机会；而且可能为研究宿主细胞与Mtb的相互作用、建立新的基于宿主细胞的诊断技术、发现新的药物靶标、开发新的抗结核药物打下了基础。

参考文献：

1. World Health Organization. (2021) Global Tuberculosis Report, https://www.who.int/publications/i/item/9789240037021.

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3. NEGRI A, et al. Identification of a mycothiol-dependent nitro-oxidoreductase from Mycobacterium Tuberculosis. ACS Infect. Dis., 2018, 4(5): 771-87.

4. MU R, et al. Nitrooxidoreductase Rv2466c-dependent fluorescent probe for Mycobacterium Tuberculosis diagnosis and drug susceptibility testing. ACS Infect. Dis., 2019, 5(6): 949-61.

5. LI X Y, et al., Detecting Mycobacterium Tuberculosis using a nitrofuranyl calanolide–trehalose probe based on nitroreductase Rv2466c, Chem Commun (Camb). 2021, 57, 13174-13177.

6. GENG P F, et al, Optimization of nitrofuranyl calanolides for the fluorescent detection of, E. J. Med. Chem.244(2022) 114835.

7. MA T, et al. Chemical resolution of (±)-calanolide A, (±)-cordatolide A and their 11-demethyl analogues. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18(3): 1079-83.

8. MA T, et al. Chemical library and structure-activity relationships of 11-demethyl-12-oxo calanolide A analogues as anti-HIV-1 agents. J. Med. Chem., 2008, 51(5): 1432-46.

9. XUE H, et al. Highly suppressing wild-type HIV-1 and Y181C mutant HIV-1 strains by 10-chloromethyl-11-demethyl-12-oxo calanolide A with druggable profile. J. Med. Chem., 2010, 53(3): 1397-401.

10. LU X F, et al. F18, a novel small-molecule NNRTI, inhibits HIV-1 replication using distinct binding motifs as demonstrated by resistance selection and docking analysis[J]. Antimicrob. Agents Chemother., 2011, 56(1): 341-51.

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原文链接：

Chemical Communications：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/cc/d1cc05187c

European Journal of Medicinal Chemistry：https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2022.114835